新物体识别、旷场实验对小鼠认知行为的影响机制

Ø 摘要

目的 研究年龄、性别对小鼠新物体再认（novel-object recognition）能力和旷场活动的影响，了解两类行为间的关系。

Ø 方法 

实验于2004-05在安徽省老年病研究所行为学实验室完成。入组的47只昆明小鼠被分成两组：青年组（七八月龄，12雄、11 雌）和老年组（17、8月龄，12雄、12雌）。采用新物体再认任务检测小鼠的非空间短期记忆能力，采用旷场任务检测小鼠的探索活性（locomotor）行为，并用主因子分析判断任务间的关系。结果[ 在新物体再认记忆任务中，老年雌鼠的新物体优先指数为（55.6±4.9）%，显著低于年轻雌鼠（66.6±3.7）%。在旷场任务中，老年雌鼠的探索运动活性减低，并且雌雄老年鼠在旷场周边所花的时间［（294.4±2.0），（289.3±4.3）s］比各自对应的青年小鼠［（278.2±4.9），（267.2±6.3）s］均多。新物体再认成绩与旷场任务中的周边时间呈正相关，而与跨格数负相关。

结论 雌性老年昆明小鼠有新物体再认（短期记忆）能力损害，且受旷场行为影响。

主题词：衰老；小鼠；学习；记忆；行为

Ø 引言

小鼠年龄相关性记忆减退，尤其是空间性记忆减退，已得到了深入研究，且海马与空间学习记忆有关已得到了充分证明［1-8］。然而，衰老对非空间性学习记忆能力的影响主要集中在电休克逃避任务上。新物体再认记忆是海马依赖性任务，但衰老是否影响该记忆尚无研究证明。昆明小鼠是中国实验室最常使用的小鼠，但对其衰老相关的行为改变很少进行探索。在目前的研究中，作者利用新物体再认程序观察昆明小鼠是否有年龄或性别相关性新物体再认（novel-object recognition，一种非空间性学习记忆）能力减退。若有，是否受类似实验环境的旷场（open-field）探索行为（locomotor）的影响。

Ø 材料和方法

设计：以实验动物为研究对象，应用两因素方差分析的随机对照、盲法试验。

单位：一所大学医院的神经内科和老年病研究所、一所大学的生命科学院。

材料：实验于2004-05在安徽省老年病研究所行为学实验室完成。实验小鼠购自安徽省医学实验动物中心（皖医动92002号）。总共47只昆明小鼠按年龄分成两组，23只七八月龄的青年鼠（12雄、11雌）和24只17、8八月龄的老年鼠（雌雄各12只）。在实验开始前对小鼠进行预选，有运动障碍、脱毛、体表可见明显肿块及大肚的小鼠被排除。实验开始5 周前，将小鼠饲养于实验室里塑料鼠笼中（大小为25.5cm×15.0cm×14.0cm），笼内放锯木屑。其中雌鼠群养（每笼四五只）、雄，单养。每天至少接触小鼠1次（拎其尾、抚摸）。除非特别提及，在整个实验期间，动物自由进食和进水。喂养环境的明暗周期为12h（7:00开灯，19:00关灯），室温为（21±1）℃，湿度为（55±5）% 。实验者不知小鼠的分组。实验在亮周期内完成。每次实验开始前1h，小鼠自饲养室移至检测室以保持小鼠对环境的适应。

设计、实施、评估者：为本文所有作者。实验采用3盲方法进行，即小鼠的分组者、实验及评估者和数据统计者的工作由3人独立完成，评估者为经过专业培训的实验员。

方法：仪器和行为学程序按照以前出版的方法加以部分修改，作者设计了一个旷场行为程序来测定小鼠的自发性探索运动活性和焦虑性，一个新物体再认行为程序来测定小鼠的非空间性短期记忆。

旷场实验：仪器由上海欣软信息科技有限公司生产， www.softmaze.com。为一开口的黑色木盒（内部大小为81cm×81cm），围墙高28cm。盒底漆成纵横各3条白线（宽3mm），从而形成16个等大的方格（每格大小20cm×20cm）。场地的中央置一彩色盒子（8cm×5cm×3cm）以激发小鼠的好奇心。照明来自一高出场地中央2.8m的40w白炽灯。每只小鼠接受1次测试，其间小鼠面朝墙放入4个拐角方格之一，并让其自由探索环境5min。每只小鼠的测试结束后，清水清洗场地并擦干。

新物体识别：装置由上海欣软信息科技有限公司生产， www.softmaze.com，是一个漆成黑色的开口木方盒子（50cm×50cm×25cm）。一白炽灯提供盒底水平约150lx的照明。在测试期间，小鼠现放入空盒内并允许自由探索5min以期适应环境。然后，将小鼠移入饲养笼内。5min后，小鼠返回盒内进入受训期。此时，有两个完全相同的物体（彩色纸盒，大小为6.0cm×6.0cm×3.5cm）于距盒壁8cm处沿一方墙直线排开。小鼠自另外两个拐角之一放入盒内，在自由探索5min后再被送回饲养笼内。待5min间歇后，动物被再引入实验盒内进行实验期的自由探索。此时，两个受训期使用过的彩色纸盒之一被一紫色小盒（7.0cm×7.0cm×5.5cm）置换并位于原位，而另一已熟悉过的彩色纸盒被移至新物体相对的拐角以防止小鼠空间的偏倚。如果小鼠用它的鼻子在1cm之内指向物体或触及鼻子则被视为探索行为。

主要观察指标：旷场任务是记录实验期内小鼠跨越的方格总数和周边时间(花在周边12个方格的总时间）。在新物体再认任务中分别记录实验期探索熟悉物体（TF）和探索新物体（TN）的时间。实验期对新物体的优先指数（PLN）被定义成TN/(TF+TN)*100%。同样，在受训期也分别记录探索物体1(T01）和物体2（T02)）的总时间，以及对物体1（PI01）和物体2（PI02）的优先指数。受训期（TTTR）和实验期（TTTE）的总探索时间也进入统计学分析。

Ø 统计学分析

全部结果以均数±标准误表示。使用的统计学方法是两因素方差分析，年龄和性别是独立变量。为避免不同性别在两因素方差分析统计时年龄相关性成绩下降的模式不同而造成的混淆，用“单性别< 的方差分析（即每个性别的单因素方差分析来显示年龄主效应［2］。类似地，“单年龄”的方差分析，即每个年龄的单因素方差分析）用于显示性别主效应。

为了探索任务内和任务间的相互关系，作者利用了主因子分析技术［2，11］与以前的研究类似［2，11］，初始因子的模式经Varimax法转换，Eigen值大于1的因子得以保留。P＜0.05时被视为有显著性。统计学分析由SPSS for window11.5软件经第一作者完成。

Ø 结果

2.1实验动物数量分析由于周期短，实验几乎不对动物造成应激、饥饿方面的影响及体力消耗，全部47只小鼠无中途脱失及死亡，所有动物的数据都进入了结果分析。

2.2旷场实验结果  老年雌鼠和雄鼠的平均周边时间比各自的青年鼠显著性延长［F(1,21)=9.96,P＜0.01;F(1,21)=8.42,P＜0.01］。这些不同主要是年龄效应所致［F(1,45)=17.44,P＜0.01］，而性别的影响较小［F(1,45)=2.99,P=0.091］。年龄和性别的相互作用极小［F(1,45)＜1］。

年龄和性别都不影响小鼠的跨格数［F(1,45)=2021,1.09;Ps＞0.05］，年龄和性别的相互作用对跨格数也无效应［F(1,45)＜1］。然而，“单性别”方差分析表明老年雌鼠的探索运动活性（locomotor activity）显著低于青年雌鼠［F(1,21)=4.87,P＜0.05］，但是，“单年龄”方差分析显示老年雌雄小鼠间的跨格数差异无显著性意义［F(1,21)=2.08,P＞0.05］。

2.3新物体再认实验结果  两因素方差分析表明TTTR和TTTE不受年龄［F(1,45)=2.21,1.09;Ps＞0.05］和性别［F(1,45)=0.24,2.78;Ps＞0.05］的影响，但受年龄性别相互作用的强力影响［F(1,43)=18.39,8.02;Ps＜0.001，0.01］。进一步的“单性别”方差分析和“单年龄”方差分析显示老年雌鼠的TTTR和TTTE显著短于青年雌鼠［F(1,21)=14.08,9.34;P=0.001，＜0.01］和老年雄鼠［F(1,22)=14.03,6.84;P=0.001，＜0.05］，但青年雌鼠比同龄雄鼠有较长的TTTR［F(1,21)=6.08,9.34;P＜0.05］和类似的TTTE［F(1,21)=1.31,6.84;P＞0.05］。然而，年龄、性别和年龄与性别的相互作用并不显著影响PI01和PI02［F(1,45/43)＜1］。

对于优先指数，当所有动物一起分析时，重复测定方差分析表明PIn 显著高于PI01或PI02［F(1,46)=18.77,14.81;Ps＜0.001］。提示在敞口场地内，昆明小鼠有记住熟悉物体并习惯于优先探索新物体的能力。影响该效应的年龄［F(1,45)=3.97, P=0.052］而不是性别［F(1,45)＜1］和年龄与性别的相互作用［F(1,43)＜1］。两因素方差分析表明年龄［F(1,45)=6.41, P＜0.05］显著影响PIn，而性别［F(1,45)＜1］和性别与年龄的相互作用并无影响［F(1,43)＜1］。“单性别”方差分析显示老年雌鼠比青年雌鼠的PIn显著要小［F(1,21)=4.47,P＜0.05］。

2.4主因子分析样本适合度的KMO值（Kaiser-Meyer-Olkin measure of sampling adequacy）为0.665（＞0.05），并且在Bartlett球形假设中P＜0.001，说明本研究中所选择的指标适合进行主因子分析。结果获得了3个有显著意义的因子。旋转于各因子上的不同变量的成分负荷。在任务内，新物体再认任务的5个指标分属于3个不同的因子，即训练期和实验期的探索总时间旋转于因子2，训练期对物体1和物体2的优先指数旋转于因子1但方向相反，而实验期对新物体的优先指数旋转与因子3；旷场任务的2个指标均旋转于因子3，方向也相反。在任务间，新物体优先指数和周边时间同旋转于因子3而方向相反，和跨格数也同旋转于因子3而方向相同。

Ø 讨论

3.1 老年小鼠的移动探索活性旷场任务是频繁应用于衰老小鼠行为学研究的任务之一［1,2,12］。本文的结果显示由跨格数代表的移动探索活性在老年雌鼠比青年雌鼠低。使用旷场或光束活性系统，以前的研究报告了其他许多株的衰老小鼠的移动探索活性降低［2,4,12］。代表移动探索活性的探索行为主要是沿场地的侧墙进行的，尽管有一个新奇物体（一个用于激发小鼠好奇心的彩色纸盒）位于场地中央。两性老年昆明小鼠的周边时间明显长于各自的青年鼠，提示老年昆明小鼠的焦虑性高于青年小鼠。这与老年大鼠和中至老年雌雄NMRI小鼠在高架十字迷宫中的观察一致。作者认为，老年昆明小鼠移动探索活性的降低很可能是焦虑性增加所致，而不是像其他研究者在对老年OF1和NMRI雌鼠进行研究时特别提到的那样是由于探索活动减少、好奇心降低和体能下降所致，因为尽管雌雄老年昆明小鼠的焦虑性均增加，只有老年雌鼠的移动探索活性降低。本文的老年昆明小鼠在旷场中表现出类似焦虑性的结果与老年C57BL/6NIA小鼠在高架十字迷宫中表现出的结果稍有不同，即17 月龄C57BL/6NIA雌鼠（该株的中年小鼠）比同龄雄鼠和青年（5月龄）雌鼠更焦虑。然而，老年鼠（25月龄）的焦虑性与青年鼠相似。由于小鼠的旷场行为与小鼠的食物储藏行为有一定的类似性，所以，昆明小鼠的旷场行为年龄相关性改变可能受其年龄相关性食物储藏行为改变的影响。

3.2老年昆明小鼠非空间认知能力的改变在本研究中，作者用了新物体再认任务来测定昆明小鼠非空间学习记忆能力是否随衰老而改变。该任务是海马依赖性任务之一，并且很少用于衰老小鼠认知能力的评价。老年雌鼠比青年雌鼠的PIN小，提示老年雌雄昆明小鼠的非空间短期记忆的某个方面有损害。最近，不同探索时间对PIn的效应已得到研究。为了获得PIn，已有人推荐总探索时间要累计到相同水平。在老年雌鼠，尽管过短的探索时间对老年雌鼠认知功能损害产生了效应的可能性不能完全排除，老年雌鼠在新物体再认任务中的较差表现很可能还是源自自身的认知功能损害。其理由是：尽管老年雌鼠在受训期和实验期的探索总时间确实要短于青年雌鼠，但两组小鼠在受训期在物体1和物体2上各花了50%的时间。在实验期，尽管青年雌鼠在新物体上花去了67%的时间（Pin=0.667），但老年雌鼠花在新物体上的时间仅56%（Pin=0.556）。这提示老年雌鼠可能由于认知能力损害而不能区别熟悉物体和新物体，从而导致花在新物体上的时间过少。

3.3 认知任务中性别的差异在各种不同的种属，空间学习记忆能力的性别差异已充分证明。在八臂辐射状迷宫任务中，青年雌鼠的成绩比雄鼠好。对于正常衰老的小鼠，很少有资料直接显示认知能力下降的性别差异。Frick等已经发现17月龄雌性C57BL/6NIA小鼠在Morris中表现出更多的空间参考记忆损害，但25月龄小鼠并无性别差异。本文结果提示某些非空间认知能力，如新物体再认能力的年龄相关性下降，在雌性要比雄性出现早。值得提及的是像以上讨论的那样，本实验中所显示的性别和年龄相关性非空间的学习记忆损害也许是雌（群养）雄（单养）小鼠之间不同的饲养环境所致。然而，饲养效应可能不是主要的混杂因素。其理由是：1年龄相关性学习记忆能力的损害仅发生在群养的老年雌鼠而不是单养的老年雄鼠身上。2在新物体再认任务中，老年雄鼠的成绩优于老年雌鼠。3单养的青年雄鼠的成绩好于群养青年雌鼠。当然，最后的结论尚需单养或群养雌雄鼠才能获得。

3.4 任务内和任务间指标的相互关系主因子分析已用于研究老年和青年小鼠以区别属于不同学习记忆任务指标的性质，但它并未用以区别学习记忆任务和感觉运动任务指标的性质。本文的结果显示新物体再认任务内的指标测定的可能是认知功能的不同方面，旷场任务则测定的是感觉运动功能方向相反的方面。一些以前的研究试图确定不同行为任务组内任务间的相互关系，但所获的结论是相互抵触的。在一个任务组内，仅发现17~22 月龄NMRI小鼠较高的旷场运动活性与其在Morris水迷宫内的成绩负相关。在另一研究中，又发现了许多任务间的相互关系。在本文的任务组内，旷场测定的是移动探索活动成分。显然，新物体再认任务也由明显的移动探索成分。

结论：本文的结果显示，新物体再认的与旷场跨格数正相关，而与周边时间负相关。这提示昆明小鼠的移动探索活性越强，新物体再认能力也越强。与此相反，昆明小鼠的焦虑性越大，其新物体再认能力也越差。